徕卡共聚焦显微镜
在徕卡共聚焦显微镜中,大面积的非相干光源经聚光镜后照射到标本上、其上每一点都可以通过物镜而成像,其分辨率取决于物镜。假如现在用小孔检测器逐点测量图像并且小孔足够小的话,图像是不变的。但在扫描显微镜中,用的是点光源和大面积检测器,而不是大面积光源和点检测器。可逆性表明,扫描显微镜和普通显微镜的成像过程是—‘样的。但是,现在是块透镜(也叫物镜,但有时叫探照灯)决定了其分辨率。
在徕卡共聚焦显微镜中,检测器前有小孔,用的光源和检测器都是点状的,这样两个透镜同等地参与成保过程,使分辨串提高1.4倍。—个点状物体在不同的显微镜中成假有如卜关系:
v=(2r5ino)
其中,横轴v是无量纲的光学座标‘是图像的真实半径,sin。是物镜的数值ZL径,A是入射光的波长。该式说明激光扫描共聚焦显微镜得到的图像更清晰。
徕卡共聚焦显微镜还有其它优点;(9散焦光线不能通过小ZL,因此可以得到光学切片的图像;②不需要的散射光也不能通过小7L。共焦系统可以采用透射式光路,但市面卜的仪器多采用反射式光路。这使得入射光研和检测光斑相重合容易实施得多。激光扣描共聚焦显微镜一般是用于检测样品的荧)L*而不是反射光。
在徕卡共聚焦显微镜中从标本上偏离焦平面的区域射来的光线在检测小儿个向是离焦的,不能通过小孔,因而产牛了光学切片的效果。通过纵向扫描,可以逐层研究切片,并建立完整的三维图像。所得到的数据可以存储在计算机中,以供日后处理和显示。
当然,三维图像难以直接显示,所以我们可以在任意某个方向取截面。例如,xZ图像就是平行于系统铀方向的切片。我们也可以得到任一方向的投影,只不过纵向信息是叠加的。投影的产生,要么通过切片的叠加产生扩展聚焦图伤,要么通过测量纵向的峰值信号而给出自聚焦图像。这两种方法都可以用数字法或模拟法实现。扩焦闯像也能直接通过在阴极射线管上照相积分而获得,用扩焦法或自聚焦法从两个稍微不同的角度进行投影,产生一个立体图像对。
在徕卡共聚焦显微镜中我们既可像在自焦方法中那样,记录纵向的峰值信号,又可记录并确定其纵向位置。这些纵向信息可以以黑白或彩色显示出表面轮廓图伤,或者结合峰值信息产生颜色编码或重构的图像。纵向测量的灵敏度约为几个纳米,如用共聚焦干涉技术灵敏度可高于0.1nm。
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